CONCENTRADO DE LEUCOCITOS Y RECUENTO DE ARNETH

Lo que queremos conseguir es un concentrado de leucocitos de una muestra para luego poder contar sus lobulaciones. Se hace una media aritmética con el numero de lobulaciones que tienen los neutrofilos que vayamos viendo en la muestra.

Los materiales que vamos a usar en esta práctica son los siguientes: vaso de precipitado, portaobjetos, pipeta pasteur, tubos de ensayo, papel film, microscopio con aceite de inmersión, papel de filtro, calculadora.

Los reactivos y muestras son: reactivos para la tinción del panóptico y sangre anticoagulada.

Procedimiento:

Lo primero que debemos hacer es la centrifugación de la sangre para poder conseguir la buffy coat ( la capa leucocitaria que vamos a necesitar) y para ello podremos dos tubos, uno que usaremos y el otro para poder compensar la centrifugadora. la pondremos durante 15 minutos a 1500rpm.

Una vez tengamos la centrifugación, eliminaremos el sobrenadante y lo colocamos en otro tubo, y con la pipeta pasteur y con mucho cuidado cogemos la capa leucocitaria que es la que nos interesa, con mucho cuidado para no llevamos nada de las otras capas.

con la buffy coat haremos un frotis y a continuación haremos un panóptico con él, los pasos los podemos ver en la practica dedicada a ella publicada anteriormente.

una vez que tenemos la tinción realizada y seca procedemos a visualizar el porta en el microscopio con objetivo de 100x y con una gota de aceite de inmersión.

procedemos a contar unos 50 neutrófilos (más o menos), e iremos contando sus lobulaciones para así poder hacer nuestro recuento de Arneth.

tipo 1=0 lobulaciones

tipo 2=2 lobulaciones

tipo 3=3 lobulaciones

tipo 4=4 lobulaciones

tipo 5=5 lobulaciones

deberemos anotar tantos los tipos que veamos, como las lobulaciones. y seguidamente podremos hacer los calculos.

Nº lobulos contados/Nº neutrófilos vistos

Resultados:

los valores normales son de 1,9-3 y a cuanto menor número, la desviacion será a la izquierda.

RECUENTO LEUCOCITARIO

lo que queremos conseguir con esta práctica es un recuento leucocitario usando la cámara de Neubauer.

La práctica consiste en la determinación de los leucocitos que hay presentes en un volumen determinado de sangre.

Los materiales que vamos a usar son los siguientes: Micropipetas con sus puntas, cámara de Neubauer, microscopio, cubre, vaso de precipitado, papel de filtro y papel absorbente, microscopio

Los reactivos y muestra que vamos va a ser: muestra de sangre y reactivo de Turck.

Procedimiento.

El procedimiento es el mismo que hemos usado en la práctica de recuento de  hematíes pero con algunas variantes que comento a continuación.

en la anterior práctica usamos una dilución 1/200, en este caso haremos 1/10, usaremos 100ml de sangre y 900ml de reactivo de turck.

Haremos la preparación en un tubo de ensayo y lo homogenizamos. Preparamos la cámara de Neubauer, colocando el porta sobre el.

cogemos 50 ul de la preparación con la micropipeta y arrimamos la punta al borde de la cámara y el cubre, y por capilaridad se ira metiendo la dilución, y una vez cargada la cámara nos vamos al microscopio.

Enfocamos con el objetivo de 40x y buscamos los cuadros para poder así poder contar los leucocitos que vayamos viendo. y los vamos anotando para realizar los cálculos.

Calculos: la formula a realizar es la siguiente:

WBC=L/4 x10x (fd en este caso ha sido 10)

Resultados: los valores de referencia son de 5000-11000 mm3

 INDICE LEUCOCITARIO

Para poder determinar y diferenciar los componentes que forman parte de la serie leucocitaria, debemos calcular el índice leucocitario y el índice de Schilling.

Lo desarrollamos haciendo una tinción diferencial con panóptico rápido en tan solo 15 segundo.

los materiales y reactivos que vamos a usar son los siguientes:
- portaobjetos
- cristalizador
- lanceta
- microscopio
- pipeta pasteur
- papel de filtro
- papel absorbente
- calculadora para recuentos y porcentajes.
- 3 duquesitas con las 3 soluciones del panóptico
- agua destilada.
- y de muestra sangre fresca.

Procedimiento:

cogemos una gota de sangre y la ponemos en un porta y realizamos una extensión.

una vez seca, seguidamente hacemos el panóptico (podemos ver su procedimiento en la práctica referente a ella).

una vez lavada y seca la colocamos en el microscopio y enfocamos con el objetivo de 100x con una gota de aceite de inmersión y vamos contando todos los leucocitos que vamos viendo, identificando y diferenciando bien los neutrófilos que veamos, si son en cayado o segmentado, y vamos anotando uno por uno lo que vamos viendo y diferenciándolos.

una vez que hemos realizado el recuento de unos 200 leucocitos nos vamos a la calculadora de recuentos y vamos metiendo los datos que hemos obtenidos, y esta nos dará los % de cada uno de los que hemos visto.

los cálculos para el índice se schilling serán:

neutrófilos en cayado en %/ neutrófilos segmentados en %

Resultados:

Los valores normales serán de 1/16= 0,0625, si el valor que nos da es alto la desviación será a la izquierda y si es bajo será para la derecha.

Determinación cuantitativa de la hemoglobina

 la hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.

la intensidad del color formado es proporcional a la concentración de  hemoglobina presente en la muestra ensayada.

la hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del trasporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.

si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.

el diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos del laboratorio.

Reactivos de Dabkin: 

hemoglobin 50x= ferricianuro de potasio 0,60 mmol/dl, cianuro de potasio 77mmol/dl, dihidrógeno fosfato de potasio 2mmol/dl.

Opcional (calibrador):

hemogobin cal= patrón de hemoglobina origen animal 20 g/dl.

el método que vamos a realizar va a ser el método macro.

RT (ml): 5ml tanto en el blanco reactivo, patrón y muestra.

CALIBRADOR (ul): 20ul en el patrón en la 1ª muestra y 15ul en el patrón en la 2ª muestra de la 2ª bolsa.

MUESTRA (ul): 1ª muestra 20ul en la muestra. y haremos una segunda bolsa con 20ul

los cálculos lo haremos con Patrón:

(A) muestra - (A) blanco/ (A) patrón - (A) blanco x 20 (concentración patrón )= g/dl de hemoglobina en la muestra.

los materiales que vamos a utilizar son: gradilla, tubos de ensayo, pipeta de 5ml con su auxiliar de pipeteo, micropipeta con sus puntas correspondientes.

ecuación de la recta, y=a+bx

y= absorbancia, x=la concentración , b= la pendiente, a= ordenada origen. Usamos patrón 1, bolsa 1 y bolsa 2. 

procedimiento: 

comenzamos preparando el reactivo, para hacer 15ml de reactivo de hemoglobin usamos 14,7 ml de agua y 6 gotas de reactivo.

continuamos preparando 3 cubetas de espectrofotómetro y los rotulamos como blanco (para el reactivo solo, 5ml), calibrador (para el reactivo, 5ml, con el calibrador, 20ml) y muestra ( para el reactivo, 5ml y muestra 20ml).

añadimos en cada cubeta las cantidades correspondientes y dejamos incubar unos 3' a temperatura ambiente.

nos vamos al espectrofotómetro y colocamos la cubetas, ponemos primero una cubeta con agua para usarlo para poner a 0, y seguidamente las 3 cubetas y medimos sus absorbancias y las anotamos, obtendremos las absorbancias del calibrador y la muestra frente al reactivo que va sin nada más.

Si queremos conseguir hacer una grafica debemos repetir los mismos procedimientos pero con otra muestra y con otra dilución, esta vez con 15ml, para tener mas puntos en nuestra grafica para poder hacer la recta.

una vez tengamos los datos procedemos a los cálculos.

con patrón: Amuestra-Ablanco/Acalibrador-Ablanco x 20 o 15= g/dl

con 20ml nos dará 38,29g/dl

con 15ml nos dará 4,80g/dl

Resultados:con 

con los resultados que hemos obtenido debemos compararlos con los valores de referencia, que son:

en hombres: 14-18 g/dl

en mujeres 12-16 g/dl