Determinación cuantitativa de la hemoglobina
la hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
la intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.
la hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del trasporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias.
si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud.
el diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos del laboratorio.
Reactivos de Dabkin:
hemoglobin 50x= ferricianuro de potasio 0,60 mmol/dl, cianuro de potasio 77mmol/dl, dihidrógeno fosfato de potasio 2mmol/dl.
Opcional (calibrador):
hemogobin cal= patrón de hemoglobina origen animal 20 g/dl.
el método que vamos a realizar va a ser el método macro.
RT (ml): 5ml tanto en el blanco reactivo, patrón y muestra.
CALIBRADOR (ul): 20ul en el patrón en la 1ª muestra y 15ul en el patrón en la 2ª muestra de la 2ª bolsa.
MUESTRA (ul): 1ª muestra 20ul en la muestra. y haremos una segunda bolsa con 20ul
los cálculos lo haremos con Patrón:
(A) muestra - (A) blanco/ (A) patrón - (A) blanco x 20 (concentración patrón )= g/dl de hemoglobina en la muestra.
los materiales que vamos a utilizar son: gradilla, tubos de ensayo, pipeta de 5ml con su auxiliar de pipeteo, micropipeta con sus puntas correspondientes.
ecuación de la recta, y=a+bx
y= absorbancia, x=la concentración , b= la pendiente, a= ordenada origen. Usamos patrón 1, bolsa 1 y bolsa 2.
procedimiento:
comenzamos preparando el reactivo, para hacer 15ml de reactivo de hemoglobin usamos 14,7 ml de agua y 6 gotas de reactivo.
continuamos preparando 3 cubetas de espectrofotómetro y los rotulamos como blanco (para el reactivo solo, 5ml), calibrador (para el reactivo, 5ml, con el calibrador, 20ml) y muestra ( para el reactivo, 5ml y muestra 20ml).
añadimos en cada cubeta las cantidades correspondientes y dejamos incubar unos 3' a temperatura ambiente.
nos vamos al espectrofotómetro y colocamos la cubetas, ponemos primero una cubeta con agua para usarlo para poner a 0, y seguidamente las 3 cubetas y medimos sus absorbancias y las anotamos, obtendremos las absorbancias del calibrador y la muestra frente al reactivo que va sin nada más.
Si queremos conseguir hacer una grafica debemos repetir los mismos procedimientos pero con otra muestra y con otra dilución, esta vez con 15ml, para tener mas puntos en nuestra grafica para poder hacer la recta.
una vez tengamos los datos procedemos a los cálculos.
con patrón: Amuestra-Ablanco/Acalibrador-Ablanco x 20 o 15= g/dl
con 20ml nos dará 38,29g/dl
con 15ml nos dará 4,80g/dl
Resultados:con
con los resultados que hemos obtenido debemos compararlos con los valores de referencia, que son:
en hombres: 14-18 g/dl
en mujeres 12-16 g/dl
